在色譜分析中，流動相必不可少，那么問題來了，如何選擇流動相？當(dāng)然，要看所要檢測樣品的性質(zhì)了，高效液相根據(jù)色譜柱的不同分為反相和正相，常用的C18柱、C8柱為反相柱，一般反相是首選，流動相的極性大于色譜柱的極性，流動相由極性較大的水和極性較小的有機(jī)溶劑（常用的是乙腈、甲醇）按照一定的比例配制而成。當(dāng)樣品為強(qiáng)親水性樣品時(shí)，流動相中含水時(shí)，在色譜柱上保留很弱，需采用非水反相色譜。當(dāng)樣品為強(qiáng)疏水性樣品時(shí)，流動相中含水時(shí)，在色譜柱上保留很強(qiáng)，需采用正相色譜。正相色譜時(shí)，流動相比例極性小于色譜柱的極性，流動相由非極性的正己烷和極性較大的有機(jī)溶劑（二氯甲烷、丙醇、異丙醇、甲基叔丁基醚等等）按照一定的比例配制而成。
　　
流動相選擇秘訣1：由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。秘訣2：三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。秘訣3：粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
　　
常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙腈，甲醇有其性價(jià)比的優(yōu)勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng)，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度;乙腈雖然價(jià)格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很少與樣品發(fā)生反應(yīng)，用作流動相系統(tǒng)常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙腈，甲醇有其性價(jià)比的優(yōu)勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發(fā)生反應(yīng)，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度;乙腈雖然價(jià)格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很少與樣品發(fā)生反應(yīng)，用作流動相系統(tǒng)壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm，增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質(zhì)的可能性，所以我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有時(shí)候樣品峰形不好或者分離不好，更換溶劑試試是一個(gè)很好的選擇，畢竟不同的溶劑提供不同的選擇性。
　　
對流動相的優(yōu)化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改善峰形、提高分離度。流動相里加堿的情況比較少，主要還是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波長下沒有紫外吸收，而三氟乙酸在低波長下有，但是三氟乙酸易揮發(fā)而磷酸不行，所以單純做液相，低波長下磷酸最合適，三氟乙酸有吸收，運(yùn)行梯度時(shí)基線漂移很嚴(yán)重，而做液質(zhì)就要考慮首選三氟乙酸了，近些年還比較流行加甲酸或乙酸。一般情況下這幾種酸沒有太大區(qū)別，我們更多的是考慮通過加酸改變流動相的pH值，從而改善樣品的分離度和峰形。
　　
相同進(jìn)樣量樣品峰越高則意味著峰形越好，從圖中可以看出多數(shù)樣品在低pH值下峰形都比中性要好，這個(gè)主要是由色譜柱本身的性質(zhì)所決定的。色譜柱主要都是硅膠基質(zhì)，現(xiàn)有的填料處理工藝無法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會造成樣品峰拖尾，一般認(rèn)為硅羥基的pKa在3.5到4.5之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，從而改善峰形，提高分離度。水溶液中添加0.1%(體積)的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流動相正好抑制硅羥基的活性，所以開發(fā)液相分析方法時(shí)流動相首選水加01.%的磷酸，然后再以此為基礎(chǔ)做優(yōu)化。
　　
在單獨(dú)用酸不行的時(shí)候就要考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩(wěn)定、緩沖能力強(qiáng)、配制簡單，需要調(diào)pH值時(shí)要有相應(yīng)的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，再有就是醋酸鹽，常用的鹽濃度在10~20mM左右。以前因?yàn)樯V柱填料生產(chǎn)工藝的問題，往往需要在流動相里添加三乙胺來減少拖尾，但是三乙胺對色譜柱的壽命有很大影響，現(xiàn)在新的色譜柱都不再需要了。流動相里有時(shí)會需要調(diào)節(jié)pH值到堿性，具體pH要視色譜柱的耐受范圍而定，常用 NaOH、KOH溶液或氨水做為調(diào)節(jié)緩沖鹽溶液堿性pH的試劑，也可以往水里單獨(dú)添加氨水做堿性流動相。